本发明属于电化学酶生物燃料电池领域，公开了一种酶催化甘油的生物燃料电池阳极及其制备方法与应用。所述制备方法为：对基底电极进行表面预处理，然后将Ｎａｆｉｏｎ溶液滴加到电极表面形成一层Ｎａｆｉｏｎ膜；然后把此电极插入麦尔多拉蓝水溶液中浸泡，使麦尔多拉蓝通过离子交换固定到Ｎａｆｉｏｎ膜中；将电极取出后洗净、干燥，得到含有介体层的电极；再将含石墨烯的壳聚糖溶液、甘油激酶水溶液、甘油３?磷酸氧化酶水溶液按比例混合均匀，滴加到上述电极表面，晾干后得到酶催化甘油的生物燃料电池阳极。本发明的产物具有成本低，催化剂及介体负载量大，催化性能好等优点，具有良好的应用前景。