本发明公开了一种测定肽分子量的一体式阀切换二维液相色谱及其应用，该二维液相色谱包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、二维切换装置、第二维进样装置和样品环；其中的第一维液相色谱柱和第二维液相色谱柱与二维切换装置连接；第二维液相色谱柱为凝胶色谱柱；二维切换装置和第二维进样装置都是多通阀，样品环连接在第二维进样装置的两个阀口之间。本发明的二维液相色谱将凝胶色谱柱作为第二维液相色谱，可以借助于第一维液相色谱的高效分离，对目标组分或全组分进行一次预分离，再经第二维凝胶色谱分析测定其肽分子量情况，可大大降低被分析组分在凝胶柱中的复杂性，从而提高其分离效率和分析准确性。