本发明涉及一种微区定位和寻回方法，采用两步定位法，在第一步定位中算出网格十字角位置的坐标值，在第二步定位中通过使用显微分析仪器中的标尺的功能，以图像中显示的标尺为参照的测量方法，综合了计算和测量的优点，不仅提高了定位的精度，将距离测量的精度提高了两个数量级，由报道的十微米级提高到百纳米级，而且大大提高了定位计算过程的容错能力，即第一步定位过程中即使定位误差达数十微米级，仍可采用本方法实现百纳米级别的定位精度；此外，应用本方法还可以在同一次测试中，使用一套标记点可定位多个目标位置，可大大提高微区分析的工作效率，同时为微区分析仪器间的关联成像提供了技术支持。