本发明涉及检测材料技术领域，尤其是涉及一种近红外生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用。所述近红外生物硫醇荧光探针包括如下结构式所述近红外生物硫醇荧光探针的制备方法包括如下步骤：化合物A与2,4?二硝基苯磺酰氯反应得到目标化合物；其中，化合物A的结构式为本发明的化合物几乎没有荧光，当与生物硫醇反应后发出强烈的荧光，并且，荧光发射波长大于650nm在近红外光区，能够与机体组织自身荧光相区分，能够有效的穿透组织消除生物背景干扰。所述化合物可用于检测生物硫醇，操作简单，具有快速、灵敏的双响应，在生物分子检测和环境领域具有广阔的应用前景。