本发明公开了一种从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法及应用。本发明通过用亲水型离子液体溶解筑波链霉菌菌丝体，再用有机溶剂萃取除去脂肪和脂肪酸等成分。然后采用疏水型离子液体－亲水型离子液体两相萃取的方法，将他克莫司等成分转移到疏水离子液体相中。最后通过超临界CO2萃取的方法进行分离纯化，得到他克莫司晶体。本发明提供的方法能有效回收他克莫司，回收率达70～85％，得到的他克莫司纯度在90％以上。该方法适合用于工业上分离纯化他克莫司。