本发明属于分析检测技术领域，公开了一种用于检测β?半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用。该探针的底物为２?（２?（二甲氨基）乙基）?６?（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）?３，４，５?三羟基?６?（羟甲基）四氢化?２Ｈ?吡喃?２?基）氧化）?１Ｈ?苯并异喹啉二酮，具有如下结构式：（ｉｍｇ　ｆｉｌｅ＝＇ＤＤＡ００００７３３９９８６２０００００１１．ＴＩＦ＇　ｗｉ＝＇７９５＇　ｈｅ＝＇３３１＇　／）本发明荧光探针的底物以萘二甲酸酐作为荧光团，并接上能对β?半乳糖苷酶特异性响应的半乳糖基团，利用双荧光信号的比值Ｉ５５４／Ｉ４４５作为检测信号，具有更好的检测准确性，１Ｕ／Ｌ的酶浓度即检测到明显的荧光变化，检测下限可达到０．３５Ｕ／Ｌ，其在可见光区域被激发（４１８ｎｍ），能消除背景干扰达到更好的检测效果。