本发明属于生物技术领域，涉及一种二型登革热病毒ＮＳ１蛋白的重链单域抗体及其制备方法和应用。发明采用羊驼非免疫重链单域抗体库，用重组表达的登革热病毒ＮＳ１蛋白通过多轮生物筛选，采用ＥＬＩＳＡ法挑选得到能特异性结合的噬菌体单克隆，并进行ＤＮＡ序列测定，然后转化至大肠杆菌中表达，即得到重链单域抗体。筛选得到的重链单域抗体能在大肠杆菌中高效表达，并能用于制备胶体金检测试剂盒检测二型登革热病毒感染，检测准确性更高。