本发明公开了一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的蛋白活性肽及其制备方法及应用。本发明以小麦面筋蛋白为原料，通过酶法水解，制备得到小麦面筋蛋白酶解液，再利用乙醇沉淀和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到七种新的能促进酵母增殖和提高酵母乙醇耐受性的活性肽，该方法制备得到的目标活性肽包括：Glu?Pro、Leu?Leu、Leu?Trp、Leu?Met?Leu、Leu?Leu?Leu、Leu?Leu?Trp、Glu?Phe?Pro?Leu。本发明所制得的小麦面筋蛋白肽能显著提高酿酒酵母的乙醇耐受性，将其应用于高浓度乙醇条件下，可有效促进酿酒酵母增殖以及提高细胞活性。