本发明公开了一种小麦面筋蛋白活性肽及其制备方法与应用。所述小麦面筋蛋白活性肽的氨基酸序列为Leu?Leu?Leu或Leu?Met?Leu。所述制备方法包括以下步骤：将小麦面筋蛋白加入蛋白酶酶解得到酶解液，酶解液通过凝胶柱洗脱，收集各洗脱组分并分别测定其在超高浓度乙醇发酵条件下提高酿酒酵母生理活性和发酵性能的能力，活性最高的组分采用反相高效液相色谱进一步分离纯化，收集各洗脱组分，通过检测鉴定得到所述活性肽。本发明采用生物酶解技术结合色谱分离技术制备出在超高浓度乙醇发酵条件下能显著促进酵母生理活性和发酵性能的小麦面筋蛋白活性肽，制备方法简单可行，制得的产品纯度高，活性强。