本发明提供了一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法及其应用。本发明在目标多肽C端插入四半胱氨酸标签并用双砷荧光染料标记试剂特异性识别并结合该序列。用Pac基团保护目标多肽中的半胱氨酸巯基侧链，随后将双砷荧光染料标记试剂脱除，将四半胱氨酸标签序列氰基化肼解获得含半胱氨酸的多肽酰肼。本发明有助于完善自然化学连接反应，更有效地合成蛋白质。