本发明提供了一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用。本发明方法采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；其中，酪氨酸侧链硫酸根采用新戊基作为保护基，半胱氨酸侧链采用三苯甲基和/或乙酰胺甲基作为保护基；然后通过合适的试剂除去侧链保护基和将目标多肽从树脂裂解下来并纯化，即得到含酪氨酸硫酸化修饰的多肽。本发明有助于我们研究酪氨酸硫酸化修饰对多肽生物活性的影响及相关机理，为相关疾病诊断及治疗奠定了良好的基础。