本发明公开一种荧光标记大分子季铵盐及其制备方法与应用。本发明将荧光素直接改性，将其分子上的羟基与氯乙酰氯进行酯化反应使得荧光素分子带有氯原子，为后续在大分子上季铵化使大分子含有荧光基团做好准备。本发明的合成过程优化了将荧光素引入大分子季铵盐的合成过程。与此同时，连接了氯原子的改性荧光素不仅是作为荧光标记的作用，在其季铵化后，还能提供水溶性和正电荷以利于大分子季铵盐在水中分散并且通过静电吸附于真菌表面从而达到抑菌的作用。本发明可以在紫外光条件下，以肉眼可见的状态直接观察到大分子季铵盐在病原真菌的菌核表面及其内部的分布，有利于研究大分子季铵盐在病原真菌中的抑制机理。